lores arbeit - wer FACSt außer mir, wer schafft eine MLR?

[lore]

lores arbeit zweiter teil:
(für diejenigen, die sich an den ersten teil "lores arbeit-was muß ich meinen doktor fragen?" erinnern: ich habe die doktorarbeit angefangen und bin bisher mit meinen aufgaben und der betreuung sehr glücklich.)

wir versuchen, eine MLR bzw. die proliferation der lymphozyten im FACS nachzuweisen, das klappt zur zeit überhaupt nicht. ob der fehler in der MLR oder im FACSen liegt, ist noch nicht klar... ich möchte wissen, ob es hier jemanden gibt, der weiß, wie eine MLR funktionieren kann (mit PHA oder IL2) oder auch mitosen am FACS nachweist (mit CFSE/CFDA oder vielleicht über CD69 oder CD 25?)

[snoop]

Also, ich weiß nicht, was ihr genau untersuchen wollt, aber eigentlich gibt es für MLRs einige Protokolle, die man mit etwas Suchen auch über Google oder Pubmed finden kann.

Grundsätzlich sind IL-2 oder PHA nichts anderes als unspezifische Stimuli. PHA hat allerdings einen relativ engen Wirkungsbereich. Will heißen: die Konz. darf weder zu tief noch zu niedrig sein (m.W. ca. 5 µg/ml, aber das kann ich aus dem Bauch heraus nicht mehr garantieren).

Ansonsten wollt ihr ja anscheinend Proliferation bzw. Aktivierung messen. Für ersteres benutzt man ganz gerne CFSE und die Abbildungen in diversen papers sehen ja auch imme wunderschön aus. Ich habe mir daran auch ziemlich die Zähne ausgebissen. Woran es genau lag, kann ich nicht sagen. Es fängt allerdings schon damit an, dass die empfohlenen CFSE-Konz. für das labeling teilweise um 1-2 Zehnerpotenzen divergieren. Hier hilft nur ausprobieren und vielleicht hast Du dann ja mehr Glück als ich.

Alternativ besteht die Möglichkeit einfach Aktiverungsmarker zu facsen. Klassischerweise wählt man dazu CD25 und CD69. Hier sollte es technisch eigentlich keine Probleme geben - vorausgesetzt, die AK sind in Ordnung und man weiß, wie ein FACS funktioniert. Wenn Du im Bereich der Aktivierungsmarker keine Unterschiede siehst, würde ich am ehesten vermuten, dass Deine Stimulation nicht funktioniert hat. Im Optimalfall sollte man das aber auch schon unter dem Mikroskop erkennen können (Proliferation etc.).

Grundsätzlich habe ich allerdings das Gefühl, dass Du nicht vernünftig betreut wirst. Eigentlich ist es nicht unbedingt die Aufgabe eines med. Doktoranden im Internet nach Lösungen für solche Probleme zu suchen.
Trotzdem viel Glück.

[Pünktchen]

Mitosennachweis mit BRDU....ging aber leider in die Hose (bin immer noch der Meinung lag am FACS, keiner hatte ne Idee woran es lag :-(( )

[lore]

Mitosennachweis mit BRDU....ging aber leider in die Hose

CFSE und die Abbildungen in diversen papers sehen ja auch imme wunderschön aus. Ich habe mir daran auch ziemlich die Zähne ausgebissen.

habt ihr noch zeit drauf verwendet, nach dem fehler zu suchen oder direkt anders weiter gemacht/ aufgehört?