Wo liegen die größten Schwierigkeiten?

[Lava]

Bevor ich mich demnächst ins Labor stürze und Bakterien quäle, wollte ich vorab mal fragen, womit man denn so am Anfang die größten Schwierigkeiten habe, damit ich da glich besonders viel Augenmerk drauf legen kann. Für den Anfang erwartet mich erst mal Folgendes: Bakterien züchten und aus denen Protein aufreinigen, FACS, Gele gießen, Westernblot, Nährmedium ansetzen... alles noch Böhmische Dörfer für mich. Woe lange braucht man, bis man das einigermaßen selbstständig und mit akzeptablen Ergebnissen durchführen kann? :-oopss

[Lisa]

FACS ist prinzipiell keine schwierige Angelegenheit, wenn man eine vernünftige Einarbeitung in das Thema bekommt und sich nicht wie ich armes Schwein als Autodidakt vor den verfluchten Kasten setzen muss. Es gibt eben ein paar Dinge, die man einfach mal gesagt und gezeigt bekommen muss, dann flutscht das facsen.
Interessanter und zeitaufwändiger ist das Ermitteln der Probenaufbereitung. Denn damit lebt und stirbt die ganze Messmethode. Immer bedenken bzw. ausschließen, dass die Vorbehandlung des Materials Einfluss auf die Proteinexpression haben kann.

Westernblot ist eine feine Sache. Lass es dir einmal von einer versierten MTA zeigen und du hast es drauf. Rein handwerklich kann man da nicht wirklich was falschmachen. Außer natürlich die Folien zu zerreißen und sonstwie arg zu pfuschen. Aber das trau ich dir eher nicht zu. ;-)

Zum Thema Bakterienzoo und zugehöriges Zuchtprocedere kann ich dir leider nicht weiterhelfen.

Viel Erfolg jedenfalls, du Unverbesserliche! ;-)

[Lava]

Viel Erfolg jedenfalls, du Unverbesserliche!
:-blush


Ich weiß schon, was das größte Problem ist: diese MTA!!!! Die weiß alles und kann alles (was sehr gut ist), lässt mich aber nur zu gern spüren, dass ich gar nichts kann und alles falsch mache. :-(

[Zoidberg]

dazu sind MTAs doch da :-))

;-)

[Lava]

@Lisa: Was für ein FACS benutzt ihr denn und welche Software? (Wir haben FACScalibur mit CellQuest auf einem Mac)
Misst du auch mit mehreren Floureszenzfarbstoffen? Hab ich bisher nicht gemacht und laut MTA wird das bei uns auch nicht gemacht, aber man kann ja nie wissen. Und wenn ich doch mal muss, muss ich ja auch durchblicken wie man diesen Ausgleich macht... ansonsten hab ich das Prinzip schon kapiert, denke ich. ;-) Und auch, dass man gefälligst immer den richtigen Puffer verwenden sollte - sonst sind die Plättchen (oder was man sonst so messen will) TOT. :-D

[Lisa]

diese MTA!!!! Die weiß alles und kann alles Mensch, schätz dich glücklich! Das ist eigentlich die Grundvoraussetzung für eine vernünftige Methodik, die nicht 25mal überarbeitet werden muss, weil man das Rad überflüssigerweise zum zweiten Mal erfindet.

Ich arbeite auch mit CellQuest auf Mac (ich hasse Mac!!).
Gibt 'n brauchbares Handbuch zu CellQuest.
Hab viele Messungen mit 2 Fluoreszensfarbstoffen (FITC und PE) gemacht. Das ist gar kein Problem. Du brauchst nur die Isotypkontrollen, d.h. IgG's vom selben Subtyp wie deine farbstoffgekoppelten Antikörper, nach denen du deine Instrument-Settings so einstellst, dass die Messwerte alle im unteren Quadranten der ersten Zehnerpotenz liegen. Das entspricht dann der Autofluoreszenz.

Und zum Thema Thrombos: Vorsicht! Die sind sauempfindlich. Die brauchen das super-sanft-und-streichel-Programm und zwar nicht nur, was den Puffer anbelangt.

[Lava]

Jepp. Nicht zu soll schütteln, sonst aktivieren sie sich von alleine, die Schlawiner. :-(

Zum Thema MTA: leider geht sie ab Januar nach Australien. Wir bekommen eine(n) neue(n), aber der/die ist bestimmt niemals so gut wie die jetzige... höchstens netter :-))

[Dr. Sziget]

Moin,
ich stehe auch kurz davor die Doktorarbeit zu beginnen, zentrales Element wird das Facsen sein. Kann mir jemand nen kurzen Abriss geben wie ich das am besten angehe oder wo die fiesesten Fussangeln sind, die ihr kennt.
Wäre toll.

Grüße
Dr.Sziget

[Die Niere]

Die fiesesten Fussangel liegen wohl nicht im Facsen selbst, sondern vielmehr in den Versuchen, dessen Ergebnis Du ja beszimmen möchtest - um was genau handelt es sich denn?

Ansonsten ist immer die zu kleine Anzahl gewachsener Zellen eine Fussangel, die einem den Spass am FACSen nehmen kann - und die Lautstärke...aber dagegen hab ich immer Red Hot Chilli Peppers ganz aufgedreht... :-D

gruesse, die niere

[Lava]

Lautstärke? Unser Gerät gibt keinen Ton von sich :-nix

Also für mich ist nach wie vor die Probenvorbereitung das größte Problem. Für schöne Kurven braucht man schöne Zellen (oder weas auch immer). Und dann muss man die richtigen Konzentrationen für das finden, was man messen will. Da pipettiert man dann teilweise im Mikroliter-Bereich. Und wenn ich dann auch noch irgendwas vorverdünnen muss, oje :-oopss

Na ja, lass es dir zeigen, pass gut auf, schreib viel mit und schau dir mal ein bisschen Theorie zum Prinzip der Durchflusszytometrie an.

[Die Niere]

Lautstärke? Unser Gerät gibt keinen Ton von sich :-nix
Und wir gestaltet sich die Kühlung von Laser und Computer? Habt ihr ein mit Kühlflüssigkeitssystem gesteuertes FACS?

gruesse, die niere

[Lava]

Frag mich doch sowas nicht! Ich bin froh, dass das Gerät nicht allzuviele Knöpfe hat. :-D Wir haben einen FACScalibur, falls dir das was sagt...