Ficoll und Buffy Coats

[Lava]

Hat hier jemand schon mal aus Buffy Coats Monos mit Ficoll aufgereinigt? Wäre für Tipps und Hinweise aller Art dankbar...

[tigerlilly2005]

also ich hab das eher anders herum gemacht. habe km-proben bekommen und mit ficoll die leukozyten heraus gefiltert. denn der dichte gradient von der ficoll lösung trennt dir erys und serum ab und läßt die leukozyten übrig. um dann aus den leukos nur die monos zu bekommen mußte ich facs analyse machen

[Lava]

Hmm... normalerweise reinigen hier einige im Labor Monos aus Vollblut auf mit Ficoll. Da wir aber zur Zeit Unmengen an Monos brauchen und nicht jede Woche 100ml oder mehr Blut spenden wollen, versuchen wir's mit Buffy Coats aus der Transfusionsmedizin. Im Augenblick machen wir gerade den zweiten Versuch damit. Das Problem heute war, dass sich die Erys nicht so schön von den Leukos haben trennen lassen und beim Abpipettieren der Leukoschicht wurden leider auch massig Erys miteingesogen. Mittlerweile haben wir das Zeug noch ein paar mal zentrifugiert und glücklicherweise gibt's irgendwann mal einen Schritt, wo die Monos im Überstand und die Erys im Pellet sind (WIE das sein kann, weiß keiner so richtig...). Jetzt gleich zählen wir sie aus, dann werden wir ja sehen, ob's funktioniert hat.
Ein FACS haben wir zwar, aber keinen Cell Sorter. Sowas braucht man ja zum Sortieren, richtig? Was hast du eigentlich mit den Monos gemacht, wenn ich fragen darf? :-)

[Dedi]

Ich hab neulich auch aus Vollblut die PBMC mit Ficoll isoliert. Die Schichten haben sich nach dem Zentrifugieren wunderbar abgetrennt, ich hab die Zellen dann gewaschen, in RPMI Medium aufgenommen und verschickt. Leider kamen die Zellen tot an. Ich kann mir aber nicht vorstellen, was ich falsch gemacht habe. Das einzige was ich mir vorstellen kann: dass die armen Zellen die Temperaturunterschiede draussen nicht gepackt haben. Oder habt ihr eine andere Idee? Was kann man da falsch machen???

[Lava]

*lol* Und gerade heute hat unsere TA erzählt, dass irgendjemand aus unserem Labor Zellen nach Australien (!!!!) geschickt hat und sie lebend angekommen sind...
Ich nehme an, Zellen sind unterschiedlich empfindlich. Manche vertragen sowas, andere vielleicht nicht.

[Lava]

So, bin mal gespannt, was da heute bei den Versuchen herauskommt. Die Auszählung gestaltete sich übrigens gar nicht so leicht! Die verdammten Zellen sind so winzig, dass man sie kaum sieht in der Neubauer Zählkammer...

Das nächste Problem war, dass die Zellen nach dem Aussäen in einer 24-Well Platte zwar schön adhäriert haben, aber sich beim Mediumwechsel leider fast vollständig wieder abgelöst haben. :-((

Das Problem, dass wir ja neben Monos auch andere Leukos dabei haben, werd ich mal mit meinem Betreuer besprechen. Entweder wir müssen tatsächlich den Cellsorter benutzen (kostet 70€ pro Stunde) oder die Aufreinigng verändern. :-nix

Übrigens vermute ich, dass sich die Erys durch die Trennungsprozedur zur Gewinnung der Buffy Coats irgendwie verändert haben und sich deshalb nocht so schön durch den Ficollgradienten abtrennen ließen. Beim Vollblut hat's bisher nämlich auch immer ohne Probleme geklappt.

[M.Cushing]

Was ihr isoliert, sind Mononucleäre Zellen, also Monozyten + Lymphozyten. Also nicht "Monos"(slang für Monozyten) mit MNCs verwechseln.

Verdünnt ihr den buffy coat ausreichend? :-top

[FataMorgana]

Ich habe auch schon PBMC mittels Ficoll aus Buffy Coats isoliet. Das hat eigentlich recht gut geklappt, an die Detailprobleme kann ich mich allerdings nicht mehr so genau erinnern.

Ich habe zum Trennen der Zellen (brauchte damals B-Lymphozyten) immer ein System namens MACS verwendet. Es funktioniert mit magnetischen Beads und einem Permanentmagneten. Ist zwar auch teuer und ein bisschen aufwändig, aber kein Vergleich zum FACSVantage.

Zum Thema Zellen verschicken: Aufgrund der Temperaturschwankungen während des Transports ist es nicht verwunderlich, wenn die Zellen - je nach Jahreszeit - kaputt gehen. Man sollte die Zellen vor dem Versand mit DMSO einfrieren und dann auf Trockeneis per Express verschicken - so kann am wenigsten schiefgehen.

[Lava]

MACS kenne ich, auch wenn wir es etwas zweckentfremdet haben :-))

Magnetische Aufreinigungen gibt es ja viele, aber müssen die Zellen dafür nicht irgendwelche Eigenschaften haben, damit man sie rausfischen kann?

Verdünnt haben wir die Buffys 1:4... übrigens haben wir bei der Aufreinigung immer einen Fehler gemacht, so dass wir die Zellen weggeschüttet und am Ende nur noch Thrombozyten hatten. Ich hoffe, unsere MTA hat das mittlerweile hinbekommen.

[FataMorgana]

Magnetische Aufreinigungen gibt es ja viele, aber müssen die Zellen dafür nicht irgendwelche Eigenschaften haben, damit man sie rausfischen kann?

Das haben die meisten Zellen doch auch!? (außer vielleicht Myelomzellen). Für FACSVantage braucht man auch einen Oberflächenmarker, damit die Sortierung gut wird.

Was für Zellen möchtest Du denn nun haben? Monozyten? Wie wäre es dann mit CD14?

[Lava]

Funktioniert das dann so, dass die Magnetbeads an Antikörper gekoppelt sind?

Und ja, wir brauchen Monozyten. Worin besteht der Unterschies zu monocytären Zellen?

[FataMorgana]

Funktioniert das dann so, dass die Magnetbeads an Antikörper gekoppelt sind?

Ja, das ist eigentlich das Prinzip von MACS. In welcher Abart setzt Du das denn ein?


Und ja, wir brauchen Monozyten. Worin besteht der Unterschies zu monocytären Zellen?

Da wäre mir keiner bekannt. Aber mit Ficoll isoliert man ja mononukleäre Zellen. Dazu gehören, wie oben glaube ich schon jemand erläutert hat, neben den Monozyten auch die Lymphozyten. Ich denke, dass es bestimmt CD14-MACS-Beads gibt, aber schau doch mal auf der Seite von Miltenyi!

[Lava]

Achsoooooo! Also unsere TA hat mir erklärt, dass wir die mononukleären Zellen für ein paar Stunden adhärieren lassen und dann waschen, dabei würden hauptsächlich die Monozyten adhärieren (auf Plastik, nehme ich an) und die Lymphozyten würden weggewaschen. Bei Vollblut hat man da einen riesen Zellverlust, aber bei Buffy Coats reicht die Menge der Monozyten wohl noch aus für unsere Zwecke. :-)

Und was ich mit den Miltenyi Beads mache, kann ich dir bei Gelegenheit mal per PN oder im Chat erklären. ;-)

[FataMorgana]

Achsoooooo! Also unsere TA hat mir erklärt, dass wir die mononukleären Zellen für ein paar Stunden adhärieren lassen und dann waschen, dabei würden hauptsächlich die Monozyten adhärieren (auf Plastik, nehme ich an) und die Lymphozyten würden weggewaschen.

Im Prinzip stimmt das, aber was dabei genau rauskommt, weiß ich nicht. Schick doch die Zellen nach dieser Prozedur mal durch's FACS, damit Du weißt, womit Du arbeitest. Das sollte m. E. schon zu einer guten Arbeit gehören, dass man die Zellen, mit denen man arbeitet, charakterisiert hat.


Und was ich mit den Miltenyi Beads mache, kann ich dir bei Gelegenheit mal per PN oder im Chat erklären. ;-)

OK, OK.