Immunfluoreszenz / P-Selectin Färbung

[Lava]

Obwohl es im Labor mehr als einen Menschen gibt, der schonmal eine P-Selectin färbung gemacht hat, kann oder will mir irgendwie niemand helfen. Daher frage ich mal hier: hat jemand Erfahrung damit oder mit Fluoreszenzversuchen allgemein?

Problem: ich möchte ganz einfach Thrombozyten zum Leuchten bringen mit einer P-Selectin Färbung. Zu diesem Zweck haben wir auch einen PE gekoppelten P-Selectin (CD62P) Antikörper. Den hab ich heute mal in einer 1:100er Verdünnung probiert und siehe da, es hat sogar geleuchtet, aber extrem schwach. So schwach, dass die Belichtungszeiten für Aufnahmen mit der Kamera jeinseits der 1s lag, teilweise bei fast 3s! Da ist es natürlich klar, dass man da kein scharfes Bild bekommt.

Was also tun? Wird das Signal stärker, wenn man einen Primär und einen Sekundärantikörper verwendet?

[test]

Also ich habe Immunfluoreszent immer mit primär und sekundärantikörper gemacht, das sollte eigentlich auch eine Verstärkung der Fluoreszenz bedeuten.

[Prostacyclinsynthase]

Ihr habt einen AK, der direkt mit Fluoreszenz gekoppelt ist? *staun*

Vielleicht habt Ihr im Kühlfach noch einen normalen Thrombocyten-Marker, den Du dann mit dem sekundären zum Leuchten bringst. Ist *deutlich* günstiger und (wie von test erwähnt) heller.

Warum bekommst Du bei Belichtungszeiten von 3s kein scharfes Bild mehr? Solange niemand am Tisch wackelt, sollte das doch kein Problem sein? (Habe selbst schon öfter mit 5s photographiert). Wie sind die Thrombos denn fixiert?

Eine andere Möglichkeit ist, den bisherigen AK zu nehmen und die letzten Waschschritte zu verkürzen. Dann sollte das Bild auch heller (und unspezifischer) gefärbt sein.

Edit: Manche AK binden nicht allzu fest an ihr Antigen, sodaß beim Waschen einiges runtergeht. Wenn Du genügend von dem Zeug hast, würde ich eine kleine Zeitreihe bei den Waschschritten machen. So bekommst Du raus, wann die unspezifische Hintergrundfärbung weg ist, aber trotzdem noch genügend AKs vorhanden sind, um ein helleres Bild zu liefern. Unser extremster AK war nach 30s waschen schon komplett runter, normalerweise wird knapp 5min gewaschen (mit PBS).
Außerdem solltest Du die AK-Lsg möglichst vom Licht fernhalten, da manche *extrem* schnell ausbleichen (man kann dann zB unterm Mikroskop zusehen, wie die Fluoreszenz abnimmt).
Bei hartnäckigen Fällen (nicht Selektin) ist ein Antigen-Demasking anzuraten. Kann via Mikrowelle, Autoklav oder Verdau erreicht werden (hab' leider gerade keinen Link da).

[Lava]

Hm, in der Box mit den Thromboantikörpern sind lauter Fluoreszenzgekoppelte. Ich nehme an, die werden auch eher fürs FACS genutzt als fürs Mikroskop. Das mit dem Waschen wär natürlich ne Idee! Ich hab jetzt mal extra doll gewaschen, weil man das laut MTA nun mal so macht. :-D Das Waschen und auch das Inkubieren geschieht alles schon weitestgehend im Dunkeln.

Warum ich immer so unscharfe Bilder habe, weiß ich auch nicht. Wahrscheinlich stelle ich mich einfach zu doof an im Umgang mit dem Mikroskop und dem Programm dazu. Durch das Okular kann ich noch scharfe Bilder einstellen, aber wenn ich auf die Kamera umschalte, wird's schwierig. Das Livebild auf dem PC Monitor ist halt etwas kleiner und da ist es schwierig zu erkennen, wann man im Focus ist.

[Prostacyclinsynthase]

...Durch das Okular kann ich noch scharfe Bilder einstellen, aber wenn ich auf die Kamera umschalte, wird's schwierig. Das Livebild auf dem PC Monitor ist halt etwas kleiner und da ist es schwierig zu erkennen, wann man im Focus ist...
Bei uns gab's damals auch zwei Probleme:

- Der Mikroskoptisch wurde per Joystick geführt, der blöderweise nicht richtig zentriert war und sich auch nicht nachträglich justieren ließ. Das Bild ist langsam gewandert, sodaß auch keine sauberen Bilder möglich waren. Wir haben dann 'nen Schalter in die Stromzufuhr eingebastelt und gut war... :-D

- Gleiches Problem wie bei Euch. Unterschiedliche Fokussierebenen zwischen Okular und Kamera (eigentlich unglaublich, bei dem Preis). Aber wir konnten beim Live-Bild die Qualität runterschrauben, damit es sehr schnell reagierte (der Rechner war nicht der schnellste), was den Vorteil hatte, daß man durchfokussieren konnte und schauen, wann einem das Bild am detailreichsten erschien. Mit ein bischen Übung hat das ganz gut geklappt. Am Anfang hab' ich oft mehrere Bilder der gleichen Stelle mit leicht verändertem Fokus gemacht - war auch immer eines dabei, das ok war.


...sind lauter Fluoreszenzgekoppelte. Ich nehme an, die werden auch eher fürs FACS genutzt...
Da werden sich die Leute freuen, wenn Du damit IHC im größeren Stil betreibst... :-oopss
Ist vermutlich billiger, wenn Du Dir eben mal 'nen Selectin-AK und den passenden sekundären bestellst. Die sek. kosten praktisch nix, bei Selectin kann ich's mir auch nicht vorstellen.

Rein interessehalber: Wie sind die Biester denn fixiert? MeOH? Zentrifugation? Formalin? Habe damals nur adhärente Zellen oder Gewebedünnschnitte unter den Fingern gehabt.

viele Grüße und viel Erfolg,
PCS

[Lava]

Das geht eigentlich ganz einfach und auch gut. Ich zentrifugiere Citratblut so, dass ich platelet rich plasma erhalte, das wird nochmal gereinigt und mit Tyrode verdünnt. Die Deckgläschen beschichte ich mit Fibrinogen und da kleben die Thrombos bombenfest dran :-)
Allerdings gebe ich vorm Mikroskopieren nochmal Cellfix auf das ganze drauf. Weiß nicht, ob das unbedint notwenig ist, stand halt so im Protokoll. :-nix