Inkubation mit Antikörper - wie lange?

[Ersa]

Ich habe mal ein Problemchen. Wir sind gerade dabei eine neue Färbung zu etablieren und waren auch schon erfolgreich mit selbiger. Heute hat sie dummerweise net gefunzt.

Es geht um ne FACS-Färbung mit nem polyklonalen Antikörper (gibt leider keinen monoklonalen). Leider hatten wir heute ne Menge unspezifischer Bindung (der Isotyp hat ziemlich viel gebunden). Nun bin ich am Überlegen, was ich denn beim letzten Mal, wo wir ne schöne Färbung hatten, anders gemacht habe. Kann das evt. mit der Inkubationzeit zusammenhängen? Ich glaube, beim letzten Mal war ich ein bisschen in Eile ( :-oopss ) und hab kürzer inkubiert, heute wieder die vollen 60 min (in einer Vorpublikation waren´s sogar 2h). Kann das der Grund sein? Ich meine, je länger ich inkubieren, bindet dann nicht auch mehr unspezifisch? Oder versuche ich gerade mir das zu einfach zu machen? :-? :-nix

[dingdong]

vielleicht ist es ja wie golgi-färbung jahreszeiten-, bzw. tageszeitenabhängig? :-D

[He-Man]

Du liegst richtig: im allgemeinen erhöht sich der Anteil unspezifischer Bindung mit Inkubationszeit, Temperatur und Antikörperkonzentration. Man kann sich an Vorpublikationen oder an den Angaben des Herstellers orientieren, aber am besten titriert man mit dem eigenen Klon die richtige Konzentration, Zeit und Temperatur aus. Falls Du in Medium inkubierst, könnte das auch zur unspezifischen Bindung beitragen. Lieber PBS mit FCS benutzen. Ach ja: natürlich muß auch die Zahl der eingesetzten Zellen gleich bleiben. Viel Erfolg!

[Ersa]

Prima, das wollte ich hören :-) Danke!

:-dance

[PhineasGage]

Hej,
habe grade mal ne Frage zur Immunhistochemie....


Hat jemand von euch ne Ahnung wie frisch das Gewebe sein sollte bis es in der Fixationslösung landet?!
Unser beratender Neuroanatomie-Prof wünscht max. 10 min ohne Perfusion/ d.h. Tod des Tieres bis zur Fixierung.
Allerdings haben wir als Versuchstiere Schweine & bis die Nerven alle draußen sind, brauchen wir deutlich länger ( aber max. 1 Stunde nach Tod des Versuchstieres).
Ist dann eine sinnvolle IHC noch möglich oder sind die Proteine schon so weit denaturiert ( CD - Protein), dass der spätere Antikörper damit Probleme bekommen würde?!

Danke für jede sinnvolle Antwort ;-)

[He-Man]

Ich kenne mich mit IHC kaum aus, habe aber im Experimentator Immunologie etwas von Perfusionsfixierung gelesen: "Hierbei werden z.B. Organe oder ganze Organismen mit dem Fixativ [...] durchgespült, indem die Lösung in die Gefäßsysteme appliziert wird. Perfusionsfixierung und Immersionsfixierung können auch in Kombination eingesetzt werden." Vielleicht wäre das eine Option?

Edit: An einer anderen Stelle heißt es: "Von der Biopsiestätte ins Labor sollten weniger als 30 Minuten vergehen." :-nix

[PhineasGage]

Hm, die Idee mit der Perfusion ist gut, allerdings ist das bei einem 50+ kg schwerem Schwein ziemlich aufwändig.....