Klonierung

[xFreakx]

Hallo,
ich hätte mal eine Frage zur Klonierung.
Ich habe ja zum einen die Ampicillin-Resistenz und zum anderen die blau- weiß - Selektion zur Sicherstellung, dass a), nur gewünschte Zellen wachsen und ich b) Zellen mit Insert habe.
Warum wird dann nach der "Mini-Präp" noch ein Restriktionsverdau mit anschließender Elektrophorese gemacht.
Meine Theorie (bin mir aber nicht sicher) ist:
ich sehe auf dem Gel die Fragmente und kann so nochmals überprüfen, ob das richtige Insert in diesem Klon eingebaut wurde. (Anhand der Basenpaare)

Aber ich mache doch hinterher auch noch eine Sequenzierung, da sehe ich doch auch, ob das richtige eingebaut wurde.

Kann mir das nur so erklären, dass es wohl billiger ist, erst die Restriktion zu machen und nur wenn die positiv ausfällt, dann die teurere Sequenierung zu machen.

Kann da jemand von Euch Licht ins Dunkel bringen ?

xfreakx

[Nemesisthe2nd]

ich würde es auch als kostenfrage sehen... und die sequenzierung ist denk auch nur um ganz sicher zu gehen...

[Xela]

wozu hast du die klonierung gemacht? northern- oder ish-sonden?

ich habe mittels "TOPO TA cloning kit" kloniert und mit "wizard plus" mini präps gemacht.

ich hab nach meiner plasmidpräp keinen restriktionsverdau gemacht, sondern statt dessen eine pcr mit einem der spezifischen primer und einem der m13-primer des plasmids. sinn der pcr war, ein template für eine northern-sonde zu generieren, also ein plasmid-dna-stück, das sowohl promotor und spezifische zu transkribierende sequenz enthält.

setzt man dagegen das ganze plasmid in die in-vitro-transkription ein, erhält man zu lange transkripte (oder sogar run-around-transkripte des kompletten plasmids), die u.u. unspezifisch binden.

vielleicht hats geholfen?


edit: sind sequenzierungen sooo teuer? wir haben ständig irgendwas sequenzieren lassen.