Fehlerquellen RNA-Isolation

[Flauscheding]

Huhu,
ich bräuchte mal wieder eure Hilfe.
Im Rahmen meiner Laborarbeit isoliere ich im Moment RNA, d.h. ich lerne noch. Nun sagte mir mein Betreuer, dass ich sehr sorgfältig und sauber arbeiten muss, da die RNA extrem fehler- und kontaminationsempfindlich ist . Das tue ich und dennoch erhalte ich recht schlechte Werte bei der RNA-Bestimmung. Vor allem kratze ich sehr scharf an einer Proteinkontamination meiner Proben vorbei und das nervt mich ein wenig. Dummerweise fällt mir bei der Fehleranalyse nichts mehr ein was ich ändern oder wo den Fehler suchen könnte.
Vielleicht habt ihr ein paar Tips oder Ideen?
Liebe Grüße,
verzweifeltes Flausche

[test]

Mit was für Zellen arbeitest du?
Welchen Kit oder System zur Isolierung benutzt du?

[Flauscheding]

Also ich arbeite mit humanen Lungencarcinomzellen.
Ein Kit hab ich gar nicht, ich "töte" die Zellen mit Trizol und isoliere die RNA dann mit Chloroform wasche mit Ethanol.
Eine Anleitung dazu habe bekommen und halte mich dran, arbeite sauber und pippettiere genau, aber irgendwie läufts nicht so, wie ich es mir erhofft hatte *hmpf*.

[test]

Die meisten Leute (inkl. mir) sind zu faul das von Hand zu machen und benutzen Kits (ich z.B. Qiagen RNeasy Kit).
Wenn du ein Problem mit Proteinkontamination hast, scheint es ja nicht daran zu liegen, dass du "unsauber" arbeitest (RNAsen Kontamination) sondern irgendwas an der Reinigung nicht optimal ist. HAt dein Betreuer da keine Verbesserungsidee?
Ansonsten könntest du mal in ein BUch wie den Experimentator Molekularbiologie gucken, der gibt oft ganz hilfreiche Tipps.

[test]

NOch ein Nachtrag, du meinst mit Chloroform wahrscheinlich Phenol/Chloroform oder? Der Schritt dient ja zur Trennung von Protein von Nukleinsäuren. Du mußt dabei sauber nur die wässrige Phase nehmen, sonst kommt es natürlich wieder zur Proteinkontamination.
Um höhere Reinheit zu bekommen könntest du diese Schritt wahrscheinlich auch zwei Mal hintereinander machen, falls du das nicht schon machst. :-nix
Würde mal deinen Betreuer fragen, was er dazu meint.

[Flauscheding]

Danke lieber Test,
das Buch werde ich mir in der Bib mal ausleihen.
Mit Chloroform meinte ich Phenol/Chloroform, da hast du Recht . Den Schritt mache ich 1x, aber wenn du sagst, dass ich ihn auch nochmal wiederholen kann, werde ich das testen.
Mein Betreuer ist im Moment auf einem Kongress und bis er wieder da ist, wollte ich eine reine cDNA synthetisieren und die RT-PCR nochmal unter Anleitung wiederholen. D.h. ich kann ihn im Moment nicht fragen und wollte/muss an diesem WE meine RNA isolieren und die cDNA synthetisiert haben.
Aber nachdem ich die Vorzüge des experimentellen Arbeitens gerade kennen lerne, nämlich die Tatsache dass grundsätzlich nichts reibungsfrei funktioniert, bin ich ein wenig gefrustet.
Aber danke erstmal und falls jmd. anderes noch eine Idee hat, immer her damit.

Was mir gerade einfällt: ich habe bisher nichts auf Eis gelagert, könnte es auch an der Temperatur liegen?

Danke nochmal und viele Grüße,
Flausche

[test]

Danke lieber Test,
das Buch werde ich mir in der Bib mal ausleihen.
Mit Chloroform meinte ich Phenol/Chloroform, da hast du Recht . Den Schritt mache ich 1x, aber wenn du sagst, dass ich ihn auch nochmal wiederholen kann, werde ich das testen.
Mein Betreuer ist im Moment auf einem Kongress und bis er wieder da ist, wollte ich eine reine cDNA synthetisieren und die RT-PCR nochmal unter Anleitung wiederholen. D.h. ich kann ihn im Moment nicht fragen und wollte/muss an diesem WE meine RNA isolieren und die cDNA synthetisiert haben.
Aber nachdem ich die Vorzüge des experimentellen Arbeitens gerade kennen lerne, nämlich die Tatsache dass grundsätzlich nichts reibungsfrei funktioniert, bin ich ein wenig gefrustet.
Aber danke erstmal und falls jmd. anderes noch eine Idee hat, immer her damit.

Was mir gerade einfällt: ich habe bisher nichts auf Eis gelagert, könnte es auch an der Temperatur liegen?

Danke nochmal und viele Grüße,
Flausche

Eis ist bei RNA eigentlich nicht zwingnd nötig, wenn erst ab dem Moment wo es in Wasser resuspendiert wird, also am Schluß, bevor man es misst und dann einfriert oder witerbenutzt. Aber eigentlich ist das auch nur sinnvoll, wenn RNAsen drin wären, was man je eh vermieden haben möchte. ;-)

Ob das mit dem Schritt wiederholen wirklich effektiv und gut ist, kann ich dir natürlich auch nicht sagen, aber einen Versuch könnte man starten, denke ich ;-) Vielleicht nicht unbedingt mit allem MAterial, das du hast. :-))

Wie testest du denn Menge und Qualität der RNA?

[Flauscheding]

Huhu nochmal,
bin im Labor angekommen, bin ja mal gespannt.
Habe nun mal vorsorglich alles auf Eis gelagert und harre der Dinge, die da kommen werden. Weiß gerade nur nicht, ob ich einen zweiten Schritt mit Chloroform wagen soll ... *sfz*, müsste sonst neue Zellen auftauen und dann dauert es wieder 2 Tage, bis sie so weit sind, wie ich sie benötige.



Wie testest du denn Menge und Qualität der RNA?


Wir haben speziell dafür ein Spektrometer ( oder wie die Dinger heißen :-D ), der misst die dann einfach. Zusätzlich habe ich für Wellenlänge 260/280 und 260/230 Referenzwerte, die die Protein- und Ethanolkontamination bestimmen.
Und bisher lag ich immer an der Kante zur Kontamination. Für meine eigentlichen Versuche sollten die Proben aber wirklich rein sein.

[test]

Huhu nochmal,
bin im Labor angekommen, bin ja mal gespannt.
Habe nun mal vorsorglich alles auf Eis gelagert und harre der Dinge, die da kommen werden. Weiß gerade nur nicht, ob ich einen zweiten Schritt mit Chloroform wagen soll ... *sfz*, müsste sonst neue Zellen auftauen und dann dauert es wieder 2 Tage, bis sie so weit sind, wie ich sie benötige.




Wir haben speziell dafür ein Spektrometer ( oder wie die Dinger heißen :-D ), der misst die dann einfach. Zusätzlich habe ich für Wellenlänge 260/280 und 260/230 Referenzwerte, die die Protein- und Ethanolkontamination bestimmen.
Und bisher lag ich immer an der Kante zur Kontamination. Für meine eigentlichen Versuche sollten die Proben aber wirklich rein sein.

Wie ist denn dein 260/280 Ratio? Und welche RNA KOnzentration und Menge bekommst du? Wie wirst du denn die DNA los?

HIer ist übrigens nen allgemeines Protokoll zur CHloroform-Phenol Extraktion:
http://en.wikipedia.org/wiki/Phenol-chloroform_extraction

[Flauscheding]

Püh, du stellst Fragen :-oopss .
Wie werde ich die DNA los? Gute Frage ... Ich wasche ja noch mit Isopropanol und Ethanol, vielleicht damit? So genau hab ich das bisher gar nicht hinterfragt, wie ich zugeben muß.

Die 260/280 Ration soll über 1,7 liegen lt. meiner Anleitung, ich schrapp vllt. gerade mal die 1,7 an. Im Schnitt liege ich bei 1,55- 1,75.
Die RNA-Menge ist unterschiedlich, meist so bei 4500ng/µl.
Danke für den Link, habs mir gleich mal ausgedruckt.
Im Moment wurschtel ich mir hier so durch, bin ja noch Frischling im Labor :-D.

[test]

Püh, du stellst Fragen :-oopss .
Wie werde ich die DNA los? Gute Frage ... Ich wasche ja noch mit Isopropanol und Ethanol, vielleicht damit? So genau hab ich das bisher gar nicht hinterfragt, wie ich zugeben muß.

Die 260/280 Ration soll über 1,7 liegen lt. meiner Anleitung, ich schrapp vllt. gerade mal die 1,7 an. Im Schnitt liege ich bei 1,55- 1,75.
Die RNA-Menge ist unterschiedlich, meist so bei 4500ng/µl.
Danke für den Link, habs mir gleich mal ausgedruckt.
Im Moment wurschtel ich mir hier so durch, bin ja noch Frischling im Labor :-D.

Die KOnzentration wäre also 4500µg/ml ? Das wäre ja eine ziemlich hohe KOnzentration, welche Gesamtmenge RNA hast du denn dann?
Wieviele Zellen benutzt du als Ausgangsmaterial?

Ich kriege so aus maximal 10 Mio Zellen ca. 30-45µg Gesamtmenge (ist aber stark vom Zelltyp abhängig) auf 30-50µl Wasser also eine deutlich niedrigere Konzentration als du hast (Kits haben aber auch eine schlechtere Ausbeute).
Bei uns liegt aber die gewünschte Ratio 260/280 für RNA Isolation bei 1,9-2,2, so kenn ich es auch ausm Experimentator Molekularbiologie, wenn ich mcih richtig erinnere.
Bei mir ist die Ratio bei Zellen, die weniger RNA Ausbeute liefern immer niedriger als bei ZEllen, die hohe RNA Ausbeute liefern, woran das liegt weiß ich nicht. :-nix
Viel Erfolg noch ;-)

[test]

Hab gerade gesehen, dass sich die DNA bei deiner Methode wohl in der Interphase sammelt, RNA in der wässrigen Phase, damit also getrennt wird. :-nix
Bei den Kits sind dafür entweder DNAsen da oder die DNA wird weggebunden.
Vielelicht findet sich ja hier noch jemand, der mit der gleichen Methode RNA isoliert und dir da besser weiterhelfen kann. :-nix

[Flauscheding]

Die KOnzentration wäre also 4500µg/ml ? Das wäre ja eine ziemlich hohe KOnzentration, welche Gesamtmenge RNA hast du denn dann?
Wieviele Zellen benutzt du als Ausgangsmaterial?

Ich hab die Zellen nicht ausgezählt, insofern kann ich dir nicht sagen, wieviele Zellen ich benutze. Ich züchte sie in Petrischalen so weit an, dass sie ziemlich dicht gepackt liegen und ich sie, sollte ich sie weiter anzüchten wollen, splitten müsste zu diesem Zeitpunkt .




Ich kriege so aus maximal 10 Mio Zellen ca. 30-45µg Gesamtmenge (ist aber stark vom Zelltyp abhängig) auf 30-50µl Wasser also eine deutlich niedrigere Konzentration als du hast (Kits haben aber auch eine schlechtere Ausbeute).
Bei uns liegt aber die gewünschte Ratio 260/280 für RNA Isolation bei 1,9-2,2, so kenn ich es auch ausm Experimentator Molekularbiologie, wenn ich mcih richtig erinnere.
Bei mir ist die Ratio bei Zellen, die weniger RNA Ausbeute liefern immer niedriger als bei ZEllen, die hohe RNA Ausbeute liefern, woran das liegt weiß ich nicht. :-nix
Viel Erfolg noch ;-)

Ich verdünne die RNA mit 30µl Wasser, wieviel ich an Gesamtmenge habe, kann man ja dann ausrechnen.

Gestern habe ich noch einen Doktoranden im Labor getroffen, der meinte, meine Werte, die ich gestern erziehlt hätte, seien in Ordnung ( Probe 1 lag bei 1,9 und Probe 2 bei 1,5 *hmpf* ). Sollte ich Probleme mit der Proteinkontamination haben, könnte ich es mit dem Kit machen, da gäbs die Probleme nicht.

Dummerweise lief die cDNA-Synthese dann nicht.
Wenn ich bloß wüsste, was ich denn nun falsch mache *Haarerauf* .

[davemed]

Hi,

wir benutzen im Labor auch Kits (Macherey-Nagel), damit habe ich bisher nie Probleme gehabt und es ist auch wirklich eine Seltenheit, wenn mal nicht genug RNA rauskommt. Was machst du denn mit der RNA? RT-PCR oder Synthese von FISH/mRNA-ISH?

Grüße,
David

[test]

Wenn wir schon dabei sind über RNA Isolation zu reden, arbeitet hier jemand mit Kits, die RNA und Protein oder sogar RNA, DNA und Protein isolieren?
Bisher haben wir Kits, die nur RNA isolieren, aber ich fände die Kombi RNA und Protein schon ziemlich praktisch. Preislich natürlich höher angesiedelt aber wenn man dafür weniger Versuche/Zeit braucht, kann sich das amortisieren.
Hat denn hier jemand mit Ausbeute und Qualität solcher Kits Erfahrung?

[Flauscheding]

Hi,

wir benutzen im Labor auch Kits (Macherey-Nagel), damit habe ich bisher nie Probleme gehabt und es ist auch wirklich eine Seltenheit, wenn mal nicht genug RNA rauskommt. Was machst du denn mit der RNA? RT-PCR oder Synthese von FISH/mRNA-ISH?

Grüße,
David

Ich mach bisher PCR bzw. RT-PCR. Da ich das im Moment noch lernen soll und am Montag den letzten Lerndurchlauf mache, möchte ich natürlich so gute Werte wie nur möglich haben. Bin da etwas perfektionistisch veranlagt :-oopss .
Na, mal sehen was mein Betreuer morgen sagen wird.

[Ulle]

Ich würde mir wahrscheinlich mal die RNA auf einem Agarose-Gel angucken und vielleicht auch einfach mal mit einer Probe eine Proteinbestimmung durchführen. Was hast Du denn mit der cDNA downstream vor?

[jilain]

Ganz kurz Offtopic, ich kann nicht an mich halten:

Schreibt alle fleißig weiter! Ich finde das Ultraspannend :D :D :D

Man wie ich mich drauf freue, Medizin zu studieren.