PCR

[Karoline.Walter]

Hallo,

mal eine Frage zur PCR, weil ich es irgendwie nie so genau verstanden habe...
Es scheitert eigentlich schon an den Primern.
Woher weiß ich denn, welche Sequenz die Primer haben müssen? Dazu muss ich doch auch wissen, welche Sequenz die DNA hat, die ich amplifizieren möchte. Und wie bekomme ich die Sequenz heraus?

[Gast26092018]

Woher weiß ich denn, welche Sequenz die Primer haben müssen? Dazu muss ich doch auch wissen, welche Sequenz die DNA hat, die ich amplifizieren möchte. Und wie bekomme ich die Sequenz heraus?
Das ist ja der Nachteil der PCR: man muss die Sequenz der DNA-Probe zumindest teilweise kennen, die man amplifizieren möchte...
DNA-Sequenzierung (http://de.wikipedia.org/wiki/DNA-Sequenzierung#Sequenzierungsmethoden)

[test]

Die Sequenzen für Mensch, Maus, Ratte und einige Tiere mehr sind zu fast 100% bekannt und können im Internet nachgeguckt werden.
So kann man sich passende Primer für seinen Anwendungszweck herstellen. ;-)

Bei NCBI wird einem geholfen ;) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

[Nemesisthe2nd]

bevor das so war musste man eben sinnvoll raten... so geschehen zB bei PCNA oder Ki67... da gabs zuerst den antikörper, dann wurde mit den antikörpern das protein isoliert...

dann die ersten und letzten paar aminosäuren bestimmen und sich daraus die Primer basteln, allerdings braucht man dafür mehr versuche, da der code ja degeneriert ist...

... und heute gehts halt über datenbanken. wenn man heutzutage "neue" gene finden will schaut man meistens cDNA Datenbanken durch die aus bestimmten geweben oder tumoren gewonnen wurden... und sucht dann "in silico" nach bestimmten wiederkehrenden motiven, die mit bestimmten funktionen aussoziert sind, zB Helix-loop-Helix motive oder zink-finger für DNA-bindende proteine...

[Karoline.Walter]

Hallo, danke schon mal...
Jetzt ist es ja so, dass man bei der Sequenzierungsmethode nach Sanger ja auch einen Primer braucht. Und woher weiß man, welche Sequenz dieser Primer haben muss?
Im Buch steht, dass man die Primersequenz deshalb kennt, weil man weiß, an welcher Stelle die Restriktionsendonucleasen schneiden.
Aber woher weiß man das?
Sorry, falls die Frage dumm ist, aber ich habe überhaupt keine Vorstellung, wie das gehen sollen... man hat ein Stück DNA, das von einem Enzym gespalten wird - woher weiß man dann, welche Sequenz die Spaltstücke an der Spaltstelle haben?

[Nemesisthe2nd]

jedes restriktions-enzym schneidet eine bestimmte sequenz die bekannt ist...
schau mal hier... http://de.wikipedia.org/wiki/Restriktionsendonuclease

so schneidet EcoR1 zB die sequenz GAATTC
also verdaut man eben das DNA stück das einen interessiert mit EcoR1, dann erhält man eben fragmente bestimmter länge. und die fragmente haben dann eben die bekannten flankierenden enden, bei EcoR1 eben AATT...

[Karoline.Walter]

Vielen Dank...
Falls ich noch Fragen habe, werde ich mich wieder vertrauensvoll an euch wenden. ;)