PCR?

[Hauke83]

Hat jemand eine wirklich gute Erklärung der Polymerase Kettenreaktion ?

[Xela]

check mal wikipedia.

[Hauke83]

Ich habe extra "wirklich gut" geschrieben.

[Nemesisthe2nd]

ja...

http://de.wikipedia.org/wiki/PCR

und da gibts auch eine "wirkliche gute" beschreibung... natürlich kannst du auch dei hieb und stichfeste quelle "der große löffler" nehmen... aber besser erklärt stehts im wiki...
eigentlich sind recht viele artikel zu molekularbiologie in der wiki recht gut..

[Hauke83]

Okay, ein Primer lagert sich an die aufgespaltene einsträngige DNA. Vom Primer an beginnt die Polymerase die einsträngige DNA wieder zu doppelsträngiger aufzufüllen. Stimmt das so?

Ich frage mich nun, woher weiss die Polymerase wieviele Nukleotide sie dranhängen soll, also wann sie stoppen soll?

[Nemesisthe2nd]

das weiß sie polymerase garnicht, sie schreibt einfach so lange weiter, bis die PCR maschine wieder erhitzt zur trennung der doppelstränge, das ist aber kein problem, da im nächsten zyklus der gegenläufige primer an das entstandene transskript bindet und so immer mehr transskripte mit der richtigen länge zu stande kommen... es gibt also ein paar zu lange fragmente, aber die entstehen nur in geringer anzahl... geht auch aus dem artikel so hervor:

"Im ersten Zyklus entstehen zunächst DNA-Einzelstränge, welche in 5’-Richtung länger als die Zielsequenz sind. Dies ist damit zu erklären, das lediglich ein Startpunkt (Primer) nicht aber ein Endpunkt exakt festgelegt ist. Der Abbruch der Strangsynthese erfolgt dabei spätestens durch die Strangtrennung im folgenden Denaturierungsschritt. Im zweiten Zyklus stehen die eingesetzte DNA sowie die gerade gebildeten DNA-Stränge zur Verfügung. An Ersterer erfolgt derselbe Prozess wie im ersten Zyklus. An die neu gebildeten DNA-Einzelstränge, welche 3’ bereits dort Enden wo sie sollen, lagern sich nun Primer in der 5’-Region an. Die nun gebildeten Stränge haben keinen 5’-Überhang, da die Polymerase auf dem Template in Richtung des 3’-Endes liest. Am Ende des zweiten Zyklus stehen damit erstmals Produkte der gewünschten Länge. In den Folgenden Zyklen vermehren sich die gewünschten Produkte exponentiell (da sie selbst als Matrize für weitere Strangsynthesen dienen), während die ungewünschten langen Produkte (siehe Produkte des ersten Zyklus) nur linear ansteigen (nur eingesetzte DNA dient als Matrize). Dies ist der theoretische Idealfall, in der Praxis fallen zudem in geringem Maße auch kürzere Fragmente als die gewünschte Ziel-DNA an. Diese kurzen Fragmente häufen sich vor allem in den späten Zyklen an, wodurch meist nur etwa 30 Zyklen durchlaufen werden um insgesamt vorwiegend DNA der gewünschten Länge und Sequenz zu erhalten.

"

[Hauke83]

Entstehen im ersten Zyklus wirklich Einzelstränge? Ich meine da werden 2 Doppelstränge erzeugt die am Anfang des zweiten Zyklus durch Erhitzen in Einzelstränge aufgetrennt werden.

[Nemesisthe2nd]

natürlich entstehen doppelstränge... aber nur ein strang ist neu... der andere strang ist natürlich in der probe die man vervielfältigen will...

beim nächsten zyklus stehen, dann einzelstränge für die primer zur verfügung. der alte aus der probe und der neue... im nächsten dann 4 (1alter 3 synthetisierte).. dann 8 (1 +7) usw... so wird auch klar warum nur wenige fragmente zu lang sind...

[roger rekless]

Ich frage mich nun, woher weiss die Polymerase wieviele Nukleotide sie dranhängen soll, also wann sie stoppen soll?

Wenn die Matrize zuende ist von der "abgeschrieben" wird.

[Hauke83]

Zitat Wiki:

Im ersten Zyklus entstehen zunächst DNA-Einzelstränge, welche in 5’-Richtung länger als die Zielsequenz sind.

Ist es nicht richtiger :

Im ersten Zyklus entstehen pro DNA-Ausgangsdoppelstrang 2 DNA-Stränge welche im Bereich der Zielsequenz doppelsträngig sind. Nach dem Schmelzen am Anfang des zweiten Zyklus stehen dadurch die beiden urprünglichen DNA-Einzelstränge und jeweils ein am 3’ und ein am 5’ Ende überlanger Einzelstrang zur Verfügung.

[Nemesisthe2nd]

nein... eine polymerase kann immer nur von 3' nach 5' schreiben... also sind beide transskripte im 5' bereich länger

beim nächsten zyklus bindet der nächste primer aber wieder am zu langen 5' ende. Allerdings an seiner spezifischen sequenz, es wird wieder entsprechend repliziert und diesmal entsteht kein zu langes transskript, da der strang an dem 3' ende nicht zu lang ist...

[Perthes]

nein... eine polymerase kann immer nur von 3' nach 5' schreiben... also sind beide transskripte im 5' bereich länger

Das wär mir neu ... :-dagegen

[Nemesisthe2nd]

ups, stimmt.... umgekehrt... von 5' nach 3'

also kann ein nach 3' längeres transskript entstehen...

[Hauke83]

Ich hatte da auch einen Denkfehler gemacht. Hatte 3' und 5' Ende mit Anfang und Ende der Zielsequenz verwechselt.

Aber im Wiki-Text wird die Richtung der Polymerasetätigkeit doch auch verwechselt?

[Nemesisthe2nd]

hnmm stimmt... die Grafik ist aber richtig... man kommt doch immer wieder durcheinander mit den enden ^^