Verzweiflung - experimentelle Arbeit - Ergebnisse deskriptiv

[clumsy_smurf]

Hallo und vorab schon vielen Dank für hilfreiche Antworten!

Wie vermutlich viele habe ich den praktischen Teil meiner Arbeit schon lang hinter mich gebracht, nach ca. einem Jahr Verdrägungsschlaf ist der Wille zurückgekehrt das "Ding" mal fertig zu bekommen.
Thema ist expertimentell-immunologisch grob gesagt bestimmte Rezeptoren und deren potentiell antiinflammatorisch/inflammatorische Rolle. Methodik umfasst Immunhisto mit Kompetition und double-staining, Western Blot und rein qualitative PCR (alles für 3 Rezeptoren, mit nem Durchschnitts-n=16) . Bis dato fand ich immer "sacke" viel Zeit im Labor verbracht zu haben, doch jetzt finde ich den Überblick ziemlich schimmelig.
Problem, meine Ergebnisse sind rein deskriptiv .. es gibt nichts was in Tabellen oder Grafiken dargestellt werden kann und zu allem Überfluss haben die Amis festgestellt, dass sämtliche Antikörper die ich verwendet habe unspezifisch sind. Nun gut, schreiben kann ich dennoch, da wir es zu Beginn nicht wußten, aber die quantitative PCR hab ich mir dann natürlich geschenkt.
Mein Problem: ich habe 0 Ahnung wie ich den Ergebnisteil gestalten soll, zB die PCR-Ergebnisse. Kann ja schlecht Gel abbilden und nur schreiben - so, da ist was dar.
Hat irgendjemand von euch etwas ähliches zu schreiben, oder eine Idee wie man "Ergebnisse umschreibt"? Im Endeffekt hat es im Moment den Begeschmack einer Bildinterpretation im Kunstunterricht ...

[Keenacat]

Ich mach eine klinische Arbeit und kann deshalb wahrscheinlich nur begrenzt helfen, aber auch deskriptive Ergebnisse lassen sich grafisch darstellen. Da mein n=30 ist, bleibt mir auch garnichts anderes übrig als deskriptiv zu arbeiten. :-)
Dazu eignen sich z.B. Boxplots oder Tabellen mit Häufigkeitsverteilungen, Balkendiagramme, Tortendiagramme (sieht alles auch sehr gut mit Häufigkeiten aus)... Was halt nicht geht ist p-Werte anzugeben. Der ist für ne grafische Aufbereitung aber auch nicht erforderlich.

Was dein Problem mit den unspezifischen Ak angeht: Ja, sowas ist echt immer ärgerlich (daher experimentelle Arbeiten nicht zu lang gammeln lassen, sonst sind sie mit Pech obsolet oder gar falsch). Das bedeutet nicht unbedingt, dass du jetzt nichts draus machen kannst. Ich würde die neuen Erkenntnisse aber unbedingt einarbeiten wenn irgendwie möglich und darauf dann aufbauen - auch dann, wenn du deinen Diskussionsteil dafür erstmal in die Tonne kloppen kannst. Musst halt einen anderen Fokus legen. Hast du mal mit Betreuer/Doktorvater gesprochen? Vllt. haben die noch Vorschläge, wie man daraus nochwas brauchbares basteln kann.

[Flemingulus]

Was meinst Du mit "rein deskriptiv" bzw. warum meinst Du, dass das ein Problem ist? Wenn Deine Befunde hinreichend "digital" sind, ist das sicher kein Problem: Rezeptor unter Bedingung XY (in Zelltyp XY) vorhanden und unter einer anderen Bedinungung (in einem anderen Zelltyp) nicht vorhanden (oder zumindest Blinder-mit-Krückstock-mäßig niedriger exprimiert).

Wenn Du eher subtilen Expressions (Lokalisations?)-Unterschieden nachjagst oder einer quantitativen Änderung der Rezeptorfunktion, dann reicht ein Bild mit sehr ähnlich fetten PCR- oder WB-Banden bzw. ähnlich bunten Zellen nicht aus. Da bräucht man jetzt etwas mehr Kontext, um Dir einen Ratschlag geben zu können. Prinzipiell gibt es natürlich die Möglichkeit, mit Freeware-Programmen oder evtl auch in Eurem Labor vorhandener Software die Dicke und "Fettheit" von Banden im Agarosegel oder auf der Blotmembran auszumessen und so zu semiquantitativen Aussagen zu kommen (die aber nochmal kritisch hinterfragt werden müssen - v. a. bei einer Quantifizierung einer qualtitativen PCR, das ist, vorsichtig gesagt, nicht ganz unproblematisch)

Und was die Spezifität des AK angeht: kein Antikörper dieser Welt ist 100% spezifisch - in geeignet geringer Verdünnung kannst Du auch mit einem GAPDH-Antikörper Actin anfärben und umgekehrt. ;-) Ist jetzt eher eine Frage, ob Du geeignete Negativ- und Positivkontrollen (Färbung nur mit Zweitantikörper - Blocking Peptide - Überexpressionssysteme - Knockdown-Ansatz o. ä.) hast, um eine Aussage zu treffen, ob der AK unter genau den von Dir verwendeten Bedingungen in genau dem von Dir untersuchten Zellsystem hinreichend spezifisch war. Was "die Amis" :-peng in ihrem Zellsystem, unter ihren Bedingungen mit ihrem Mikroskop gesehen und publiziert haben, ist da erstmal zweitrangig.

Auf alle Fälle: mach Dich mal nicht verrückt und lass Dich - in erster Linie - von Deinem Betreuer und - im Nebenschluss - gerne auch anderswo (hier?) noch ewas beraten. :-)

[Flemingulus]

Ich mach eine klinische Arbeit und kann deshalb wahrscheinlich nur begrenzt helfen, aber auch deskriptive Ergebnisse lassen sich grafisch darstellen. Da mein n=30 ist, bleibt mir auch garnichts anderes übrig als deskriptiv zu arbeiten. :-)
Dazu eignen sich z.B. Boxplots oder Tabellen mit Häufigkeitsverteilungen, Balkendiagramme, Tortendiagramme (sieht alles auch sehr gut mit Häufigkeiten aus)...

Ich glaube, Clumsys Problem ist eher, dass sie/er Bilder von Gelen, Membranen und Zellen hat und nicht so genau weiß, wie daraus Zahlen zu generieren sind, welche sich dann wiederum in einem Diagramm/einer Tabelle darstellen lassen. Bin aber nicht ganz sicher, ob ich das so richtig verstanden hab.

[Keenacat]

Ich glaube, Clumsys Problem ist eher, dass sie/er Bilder von Gelen, Membranen und Zellen hat und nicht so genau weiß, wie daraus Zahlen zu generieren sind, welche sich dann wiederum in einem Diagramm/einer Tabelle darstellen lassen. Bin aber nicht ganz sicher, ob ich das so richtig verstanden hab.

Aaaaachso. auf die Idee bin ich jetzt garnicht gekommen. :-notify
Das ist natürlich schwierig, da kann man halt versuchen, Moleküllängen anzugeben (im PCR müsste ja ne Leiter (diese Probe mit versch. Standard-Banden) dabei gewesen sein), Zellauszählungen o.ä. Jedenfalls würde ich das jeweilige Experiment so beschreiben, dass es gegebenenfalls reproduzierbar ist.

[Flemingulus]

Eine klare Beschreibung der Versuche (im Methodenteil) und der Ergebnisse ist natürlich auch bei einer "Bildergeschichte" ohne Tabellen- und Diagrammgedöns nötig und frisst etliche Seiten (so dass eine Doktorarbeit mit rein qualitativen Ergebnissen net unbedingt kürzer wird als eine mit quantifizierten Befunden ;-) ). Ob über das Zeigen von PCR- und WB-Flecken und von bunten Zellen hinaus noch Zahlenschieberei notwendig ist, hängt halt jetzt - wie gesagt - von der Fragestellung und von der Eindeutigkeit der "results" ab.

[clumsy_smurf]

Was meinst Du mit "rein deskriptiv" bzw. warum meinst Du, dass das ein Problem ist? Wenn Deine Befunde hinreichend "digital" sind, ist das sicher kein Problem: Rezeptor unter Bedingung XY (in Zelltyp XY) vorhanden und unter einer anderen Bedinungung (in einem anderen Zelltyp) nicht vorhanden (oder zumindest Blinder-mit-Krückstock-mäßig niedriger exprimiert).

Und was die Spezifität des AK angeht: kein Antikörper dieser Welt ist 100% spezifisch - in geeignet geringer Verdünnung kannst Du auch mit einem GAPDH-Antikörper Actin anfärben und umgekehrt. ;-) Ist jetzt eher eine Frage, ob Du geeignete Negativ- und Positivkontrollen (Färbung nur mit Zweitantikörper - Blocking Peptide - Überexpressionssysteme - Knockdown-Ansatz o. ä.) hast, um eine Aussage zu treffen, ob der AK unter genau den von Dir verwendeten Bedingungen in genau dem von Dir untersuchten Zellsystem hinreichend spezifisch war. Was "die Amis" :-peng in ihrem Zellsystem, unter ihren Bedingungen mit ihrem Mikroskop gesehen und publiziert haben, ist da erstmal zweitrangig.

Auf alle Fälle: mach Dich mal nicht verrückt und lass Dich - in erster Linie - von Deinem Betreuer und - im Nebenschluss - gerne auch anderswo (hier?) noch ewas beraten. :-)

Also erstmal superlieben Dank für die Antwort, dass läßt wieder ein wenig Mut aufkommen!
Zum ersten Teil des Zitates: Genau darauf läuft es hinaus .. PCR wir sehen Proben A-K, Probe D auch im Nachversuch ohne Ergebnis, sonst qualitativ überall cDNA gefunden in Höhe x bp entsprechend Primer (tatsächlich ohne Verunreinigung), dass für alle 3 Rezeptoren inkl HG. Wirklich Unterschiede in Bandenstärke oder -breite erscheinen mir hochspekulativ.
Ähnlich Immunhisto, wir sehen gefühlte 750 Mio Schnitte an verschiedenen Tagen in unterschiedlichen Entzündungsstadien in unterschiedlichen Organen .. ja es scheint eine vermehrte Immunoreaktivität nachweisbar wie vor Beginn der Arbeit gedacht.
Tja und verbleibend die Western Blots, die haben irgendwie gemacht was sie wollen und nur 2 Rezeptoren waren in dem kD-Bereich wo sie hinsollten. Fast alle Proben wurden in der Methodenetablierung "verschossen" da ca. 15 unterschiedliche Blockierungen sowie Inkubationsansätze getestet wurden. Zu allem Überfluss liefen dann die AK :-((der Immunhisto nicht im WB, so dass auch die AK im Verlauf geändert wurden und ich teils Immunhisto nachgelegt habe.
Rein theoretisch gibt es da auch "Auswertungen" über die Banden nur leider versteh ich da grad Bahnhof und ein Teil der Daten scheint verschüttet.Des weiteren wußte ich während den Western Blots schon, dass ich meine Immunhisto kaum bestätigt bekomme (im Sinne einer entzündlichen Upregulation)

Ach so könnte ich noch stundenlang weitermachen, aber zum 2. Teil des Zitates: Ja, ich habe Negativ-Kontrollen und zwar Präabsorptionen mit Peptiden und die haben sowohl immunhistochemisch als auch im WB (zumindest für 2 AK) funktioniert und ich habe Positiv-Kontrollen im Sinne von Doppelfärbungen.

Fakt ist, irgendwas hab ich nachgewiesen, aber es ist nicht was wir dachten bzw. nicht so spezifisch wie erhofft, denn das wurde klar aus US wiederlegt.
Da es aber vorher nicht bekannt war kann es lt. Betreuer ohne Probleme geschrieben und eingereicht werden zumal ein nicht unerheblicher Aufwand betrieben wurde.
ABER ich habe null Schimmer wie man dieses ganze Drama niederschreiben soll ohne permanent "hier dachten wir das", "es wurde versucht das", "der Gedanke war" "es scheint" etc. Ich will überhaupt keine Zahlen, Graphiken oder Boxplots, denn dann wäre es alles noch komplizierter, da unzusammenhängender.
Nur wie fange ich es überhaupt an? Immunhisto 1 .. wir sehen .. mit Färbung an zB Mukosa und Makrophagen .. Immunhisto 2 bei Progress des inflammatorischen Geschehens läßt sich lokale Invasion der Immunzellen darstellen, zunehmende Immunoreaktivität in den eingewanderten Zellen als auch im lokalen Gewebe .. . .. das kommt mir doch reichlich :-sleppy vor!

Für alle Grammatik- und Rechtschreibfehler entschuldige ich mich, bin endmüde vom vielen Starren auf Banden und Zellen :-)

[Flemingulus]

ja es scheint eine vermehrte Immunoreaktivität nachweisbar wie vor Beginn der Arbeit gedacht.

"Wie vor Beginn der Arbeit gedacht" klingt so negativ. Du bist im Moment offenbar im Alles-ziemlich-schwarzseh-Modus... das ist zum Zusammenschreiben net so hilfreich ;-) Versuch mal die negativen Sichtweisen möglichst zu unterdrücken. Und ganz schlecht sind auch feste Denkschemata: "nach Stimulation mit Schlagmichtot hätte die Expression von Protein XY doch hochgehen müssen und jetzt isses gleich geblieben: verdammt... dann ist alles schief gelaufen... aaaaaaaah". Auswertung und Beschreibung von Ergebnissen macht man am besten in stimmungsmäßig neutraler Mittellage. :-)


Tja und verbleibend die Western Blots, die haben irgendwie gemacht was sie wollen und nur 2 Rezeptoren waren in dem kD-Bereich wo sie hinsollten.

Wie groß ist die Abweichung? Schwerere Banden als erwartet bekommt man oft durch alternative Glykosylierung (grad bei Rezeptoren). Viel schwerere Banden als erwartet (etwas weniger als doppelt so schwer) bekommt man durch Dimerisierung des Proteins (entweder erst im Gel oder bereits in der Zelle). Kleinere Banden sind evtl. unreifes (unvollständig synthetisiertes) Protein oder Bruchstücke. Sind das Ganzzell-Lysate oder Gesamtmembranisolierungen, so dass Du auch wachsende Peptide aus dem rER usw. miterfasst? Ist der entsprechende AK eher gegen den N-Terminus oder eher gegen den C-Terminus des Proteins gerichtet (und also in der Lage, auch "unfertiges" Protein zu erfassen oder eben nicht)?

Und dann gibts munter dazwischengestreut auch noch unspezifische Banden, die idealerweise deutlich schlechter mit einem Blockingpeptid blockierbar sind. Wenn das Blockingpeptid aber mehr wie ein Scavenger für den Primärantikörper funktioniert (vor allem bei einer Präinkubation), dann können auch unspezifische Banden durch das Peptid verschwinden. Dann wäre es schön, wenn die unspez. Banden auch in PCR-negativen Zellen auftauchen und sich auf diese Weise enttarnen. Solche unspezifischen Banden sind übrigens gar nicht immer so unwertvoll, da sie als eine Art Ladekontrolle benutzt werden können. :-)


Fast alle Proben wurden in der Methodenetablierung "verschossen" da ca. 15 unterschiedliche Blockierungen sowie Inkubationsansätze getestet wurden.

Bei Expressionsanalysen ist die Leistung eines WB üblicherweise sowieso weniger, die Ergebnisse einer Immunhisto zu bestätigen sondern eher die Spezifitität des Antikörpers zu überprüfen (im Idealfall: Ak erkennt im WB nur eine Bande und die ist auf der richtigen Höhe - siehe aber auch Bem. eins weiter oben).


Zu allem Überfluss liefen dann die AK :-((der Immunhisto nicht im WB, so dass auch die AK im Verlauf geändert wurden und ich teils Immunhisto nachgelegt habe.

Nirgends steht geschrieben, dass alle AK, die in der Immunhisto verwendet wurden, zwingend auch im WB verwendet werden müssen und umgekehrt. :-)


Des weiteren wußte ich während den Western Blots schon, dass ich meine Immunhisto kaum bestätigt bekomme (im Sinne einer entzündlichen Upregulation)

Schon wieder so negative Untertöne: wussten wir eh alles vorher schon... AK taugen sowieso nix... WB sehen doof aus... alles mist... wir müssen alle sterben.

Ich glaub Du brauchst mal einen, der Dich ordentlich schüttelt und Dir dann einen Schnaps spendiert. Und dann schreibst Du den Mist endlich zusammen!


Ja, ich habe Negativ-Kontrollen und zwar Präabsorptionen mit Peptiden und die haben sowohl immunhistochemisch als auch im WB (zumindest für 2 AK) funktioniert und ich habe Positiv-Kontrollen im Sinne von Doppelfärbungen.

Dann freu Dich! Das ist schonmal gar nicht so schlecht. Gibt genug, hauptsächlich auf RT-PCR und auf Immunhisto/cytochemie basierende med. Doktorarbeiten, die keine, auch nur im Ansatz validen, Positiv- und Negativkontrollen vorweisen können.


denn das wurde klar aus US wiederlegt.

Das ist nahezu unmöglich wegen siehe früheres Post von mir.

[clumsy_smurf]

@Flemingulus: Dank dir für die ausführliche Antwort, hab mir davon einiges eigentlich vieles Mal zu Herz und Gemüt geführt und werde versuchen meine Einstellung zur "neutralisieren" :-blush
In der Tat bin ich grad nur am Schwarzmalen, da ich jetzt noch ein zweites Mal erlebe, was so alles nicht nach Vorstellung lief und die Tatsache, dass sich das Kind ja "experimentell" und nicht "gesichert und bestätigt" nennt vergißt man doch schnell.
Zumindest ein WB-Problem scheint mit Proteinfragment zu benennen zu sein.. mal schauen. Ich werde ab Sonntag einfach mal mit dem "hier ein Bild, dass die Erklärung"-Schreiben anfangen und dann :-kotz ich ab nächster Woche weiter.

Die vermeintlich letzte Frage vor dem WE, betreffend Immunhisto, wo packe ich den vermeintlich allgemeinen Teil (das Organ, die Zellen jene Zellen, die Makrophagen und Lymphozyten interessieren besonders und haben diese Zellbesonderheiten) im ganz kurzen Stil hin? Vor die eigentlichen Bilder oder doch in die Einleitung? Allerdings hat die Einleitung schon echt einige Unterkapitel bis ich dort bin wo ich immunologisch hinmuß, vor meinen Rezeptoren und deren Rolle ist noch kurzer Abschnitt T/B-Zell-Funktion/Kommunikation ..ach du Alarm .. :-((

[Hellequin]

Also wenig Statistik und Grafiken sind im Rahmen einer experimentellen Arbeit kein Problem. Die paar Statistiken die ich in meiner Arbeit hatte haben sich hauptsächlich mit der Geschlechts- und Altersverteilung der Probanden, sowie der Anzahl der hoch- und runterregulierten Spots bei der Gelelektrophorese beschäftigt. Tolle Grafiken hatte ich gar keine in meiner Arbeit. Hat trotzdem für eine gute Note gereicht (ohne das jetzt irgendwelche hammergeilen Nobelpreisverdächtigen Ergebnisse dabei herausgekommen sind).
Was das schreiben angeht, würde ich empfehlen sich ein paar Arbeiten rauszusuchen welche sich mit einer ähnlichen Fragestellung und/oder Methodik befassen, einfach um mal einen Eindruck zu bekommen wie man sowas strukturieren kann. Man muss das Rad schleißlich nicht neu erfinden. Ansonsten würde ich empfehlen die Sachen die du weißt einfach schon mal zuschreiben, umstruktieren kann man auch noch im Verlauf. Insbesondere die Methodik ist da meist ein relativ dankbarer Einstieg, da es ja eine reine Ablaufbeschreibung ist.