Mutagenese-Primer-Design

[Evista]

Hallo,

ich bin auf der Suche nach einer guten Einführung in das Primerdesign vor allem für die Mutagenese-PCR; sowohl Bücher als auch Onlineskripte, die auch die Grundlagen gut erklären, sind willkommen!

Mir leuchtet noch nicht ganz ein, woher man das Wissen nimmt, welche Nukleotide man denn verändern muss. Auch interessieren mich die unterschiedlichen Vorgehensweisen zur Deletion und Insertion, außerdem wann was eher von Vorteil ist. Es ist relativ schwer, sich in dieses Riesenfeld einzuarbeiten, weshalb ich euch für jede Hilfe mehr als dankbar bin!

[cKone]

Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit von Stratagene benutze ich immer.
Im Manual gibt es auch Primer Design Guidelines.
Prinzipiell änderst du für Deletionen Basentriplets hin zu einem StopCodon. Meistens reicht dafür die Änderung einer Base aus.
Insertionen sind da schon etwas anspruchsvoller, da du erst einmal Schnittstellen für Restriktionsenzyme einfügen musst. Die Schnittstellen dürfen natürlich auch nur für sogenannte single cutter spezifisch sein, denn du musst beachten das in deinem Plasmid oder auch speziell in deinem Gen evtl. weitere Schnittstellen für dasselbe Restriktionsenzym existieren.
Dann wird eine Ligation durchgeführt und deine Insertion ist fertig.
Theoretisch ist das alles sehr einfach, praktisch gibts aber immer wieder Fehler.


Der Experimentator: Molekularbiologie / Genomics von Cornel Mülhardt kann ich dir sehr empfehlen, sehr gutes Buch in diesem Zusammenhang. Ansonsten einfach mal bei Google suchen! Zu diesem Thema gibt es sehr viele, hilfreiche Seiten